【胆碱酯酶催化反应】
拼译：cholinesterase catalyzing peaction
胆碱酯酶是一类专一性的水解酶，催化胆碱酯类(如乙酰胆碱)及其它一些酯类的水解反应。胆碱酯酶在胆碱能传递和运动神经末梢水解乙酰胆碱(Ach)，维持正常的神经活动的机体运动功能中起重要作用。从分子水平上研究胆碱酯酶催化乙酰胆碱或拟胆碱药物的反应动力学和机理，对深入探讨酶的生理功能、酶与底物的作用机制、增强药物临床的实用性等方面均有重要意义。
胆碱酯酶可分为真性胆碱酯酶和假性胆碱酯酶。前者也称乙酰胆碱酯酶(AchE)，主要存在于神经之中(特别是胆碱能神经之内)、神经肌肉接头处以及红细胞和肌组织内，对于低浓度(接近生理浓度)的乙酰胆碱和醋甲胆碱的作用最强。假性，胆碱酯酶主要指丁酰胆碱酯酶(BucE)，存在神经胶质细胞、血浆和肝脏中，其生理功能尚不十分清楚。1967年，咯伊青格尔(W．Leuzinger)指出AchE是一种糖蛋白，含少量的氨基糖和半乳糖胶。1973年，洛伊青格尔获得AchE结晶，为研究AchE的结构提供了必要的实验材料。AchE分子量约8万，它的一级结构是线性多肽链，其氨基酸组成及酯解部位活性氨基酸附近的氨基酸顺序均已发表。1967年，洛伊青格尔对电鳗电器官的氨基酸组成进行了测定，1972年罗森伯里(T．L．Rosenberry)等对之进一步修正。1973年，库曼(V．Kuman)等也先后对金环蛇毒、牛红细胞、电鳐电器官等AchE进行了氨基酸组成测定，发现氨基酸含量酸性的为19%～23%，碱性的为12%～13%，其余的为中性，因而均为酸性蛋白质。不同来源的AchE氨基酸组成相似，亲缘关系越近，相似性越大。采用32P标记的有机磷化合物，使酯解部位酰化基团附近的氨基酸排列顺序得以确定。1959年詹兹(H．S．Jansz)研究马血清的BuchE，指出氨基酸顺序为甘－谷－丝*－丙－甘。而AchE活性区域肽片的氨基酸顺序是1973年谢弗(W．K．Schaffer)在对电鳗电器官的研究中弄清的：甘－谷－丝*－丝－谷。酶分子表面能够识别底物并催化其转变的局部结构即活性区域是在蛋白质的3级结构中形成。威尔逊(Wilson)首先提出胆碱酯酶活性区域的模式图，又经后人修正补充。一般认为由酯解部位、阴离子部位及周围部位等组成。酯解部位，即AchE使底物水解的催化部位至少由3个活性基团构成：碱性亲核基团由组氨酸咪唑基构成，酸性基团由酪氨酸酚羟基构成，酰化基团由丝氨酸羟基构成。酯解部位存在一个埋藏在酶分子内部的解离的门冬氨酸，它吸引组氨酸咪唑氮原子上的一个质子，产生共轭效应，使咪唑基上另一个氮原子与丝氨酸羟基上的质子形成氢键，从而增强活性丝氨酸上氧原子的亲核活性，后者与乙酰胆碱中的羰基碳原子结合。1953年，芒特(L．A．Mounter)观察了巯基试剂对胆碱酯酶的影响，指出胆碱酯酶活性中心不包括巯基。1963年，周延冲等通过交叉抑制实验证实：至少对于电鳐的AchE，巯基是该酶活性区域内的一个活性基团。阴离子部位可能是门冬氨酸或谷氨酸的羧基构成的，AchE阴离子部位的羧基呈解离状态，而BuchE的羧基不解离或解离度很小。1965年，凯勒(J．C．Keller)等研究一系列具有不同离子半径的季胺离子与酶的阴离子部位的作用规律，发现当季胺离子具有高度对称性时，特别是具有致密形式时，静电亲和力最强，取代基以丙基最好。因而推论阴离子部位是一个能容纳大约0．110～0．150nm3的小腔，腔内有一个点电荷，可与底物的阳离子基团相结合。疏水区由胆碱酯酶活性区域氨基酸的碳氢键所构成，具有明显的亲脂性质，在与底物或抑制剂作用时，可以与其分子中的疏水基团结合，同时排斥亲水性基团，把亲水性酰基团推向酯解部位，促进反应的发生。1970年，卡兹尼克(M．I．Kachnik)提出AchE和BuchE活性区域疏水区的模式图，指出阴离子部位各有两个疏水区，酯解部位AchE有一个疏水区，BuchE有两个疏水区。1980年，维拉泰勒(O．M．Viratelle)等通过对电
等动物的胆碱酯酶动力学研究表明，不同种类的胆碱酯酶的一些物理性质明显不同，但它们却具有本质上同一的催化性质。这可能是“内部”多肽皱褶，内部残基顺序相近或相同的缘故。1978年，卡托德(J．Cartaud)指出AchE的最小活性单位亚基呈球状结构，直径约5nm，它具有完全的胆碱酯酶活性。现已确认，每个种属只有一个亚基，每个亚基只有一个活性部位。各个活性区域独自起催化作用，亚基间相互作用不敏感，催化活性都是相等的。1975年西尔曼(I．Silman)指出，由于在天然状态下与膜结合的AchE活性区域反折进去形成一个半封闭的囊腔，因此构成一个微环境。微环境中H+浓度及底物梯度的形成，对膜结合的AchE的活性影响很大。真性胆碱酯酶和假性胆碱酯酶催化胆碱酯类底物的水解反应速率是不同的。一般来说，AchE催化胆碱酯水解速度顺序是：乙酰胆碱＞丙酰胆碱＞丁酰胆碱，并能专一地催化水解β－甲基乙酰胆碱。而BuchE催化胆碱酯的速度顺序则与AchE相反，它却能专一地催化水解苯酰胆碱。不同种属动物的非特异性胆碱酯酶在底物专一性方面有一定的差别。人们一直试图从微观上揭示胆碱酯酶与底物相互作用的本质，但由于酶催化反应受到诸多因素的影响，从分子及电子水平上对于其本质探讨并不乐观。1938年，泰勒(Taylor)已经尝试用电子极化效应来说明酯酶的反应机制。1962年，科什兰(D．E．Koshland)指出酶反应中邻近效应和定向效应的重要性。1970年，他进一步提出轨道取向，认为酶活性中心和底物的电子轨道进行高效的轨道取向，造成反应以104数量级的加速。1971年，布鲁斯(T．C．Bruice)等对轨道取向的设想提出疑问。1973年，梅山以具体酶为例，认为轨道取向在酶催化反应中是重要的，由于丝氨酸残基－OH离解成－O－，“攻击”底物的羰基碳，亲核攻击阶段是反应速度的限制步骤，因而取决于－O－基(P轨道)和羰基碳(P轨道)电子轨道重叠的稳定性。随着轨道取向变坏，能量急剧变化，对应于10°约达0．75eV之多。1973年，费雷拉(R．Ferreira)应用轨道对称性的设想来解释酶反应机理，认为底物与酶的活性中心之间的电子移动使反应物到产物的过程对称性禁止变为对称性允许。关于AchE催化反应动力学的研究，近年来认为酶与底物首先形成米氏络合物R－C(=O)X…E…OH，进一步形成诱导契合复合物(四面体中间体)，其随底物酯键的断裂，胆碱离去，生成酰化酶，酰化酶最后水解，酶活性得到恢复。1975年，罗森伯里提出一个AchE诱导契合模式图，在低浓度Ach为底物时，米氏络合物的生成是限速步骤，在高浓度Ach为底物时，去酰化反应是限速步骤。限速步骤因底物及反应条件的变化而不同。AchE亚基间没有协同反应，但配体结合在周围部位可导致亚基内活性区域的别构效应。1963年，米泽贞次郎等首次从量子化学分子水平上研究了胆碱酯酶催化水解反应，他们以二甲胺基乙酸乙酯与胆碱酯酶的反应体系作了简单的HMO法讨论，粗略计算在过渡状态附近产生酶与底物间电子移动模式的非定域能，并与实测的活化焓比较，较好地吻合。但他将此体系作为完全的共轭体系来处理，并忽略σ电子的作用。1987年赵成大等认为，从电子水平看，胆碱酯酶催化作用的实质乃是诱使参与反应的前线轨道处在空间定向化和使MO的对称性适应化的协同效应的结果，降低了活化能，底物水解速度加快。1991年，苏忠民等通过量子化学半经验CNDO／2方法，采用模型分子计算胆碱酯酶与乙酰胆碱及同系物的相互作用能，探讨了胆碱酯酶催化水解乙酰胆碱同系物的规律，进一步证实轨道取向在酶化反应中的适用性，把轨道取向、非定域能与水解速度、药效等有机联系起来，指出在催化反应中活性中心的组氨酸残基侧链咪唑与丝氨酸的羟基原已形成的较牢固的氢键，在羟基进攻底物羰基过程中逐渐减弱，羟基氢逐渐迁移至咪唑端，而底物的胆碱部分随羟基－O的进攻而协同地离去。尽管像溶菌酶等酶的结构已通过X射线衍射方法得以确定，但胆碱酯酶的微观结构尚未全部弄清。从分子水平探索催化反应机制和模拟应用仍有待发展。随着人们对胆碱酯酶分子结构和生理生化功能研究的深入，高分子模拟功能酶应用于催化将是一个意义十分巨大的课题。有效控制生物体内乙酰胆碱含量，抗胆碱酯酶药物、拟(或抗)胆碱药物的设计与研制也将更活跃。测定分析酶结构和动、热力学的实验手段如X射线衍射、核磁共振等也将取得进展。有机磷等对人体、动物甚至植物体中的胆碱酯酶有很强的抑制作用，随着酶活性被抑制的毒理的揭开，高效有机农药的合成与筛选工作也将得到推动。采用量子化学方法，从底物与胆碱酯酶间的电子移动、分子轨道间相互作用等角度研究酶的催化作用，可能是今后研究酶反应的一种饶有兴趣的工作，并随着计算机的发展而逐渐深入展开。【参考文献】：1 Leuzinger W. Proc Natl Acad Sci. USA, 1967.57:46 - 4512 Rosenberry T L. Proc Intl Meeting Splil Croatica Chemica Acta,1975.235～2403 米泽贞次郎．量子化学入门．东京：化学同人，1963．275～2804 孙曼霁，周廷冲．生物化学与生物物理进展，1981，(3)1～145 苏忠民，崔瑞海，王荣顺．催化学报，1992，(2)∶138～141(东北师范大学苏忠民博士撰；王荣顺审)