【空泡膜类型H+－ATPase】
已知的膜质子泵ATPase有3种：质膜E1E2类型的P－ATPase；线粒体(或称真细菌)F1F。类型的F－ATPase，即ATP合成酶；空泡膜类型的V－ATPase，核类型ATPase广泛地存在于真核细胞的高尔基体、内质网、溶酶体、嗜铬颗粒、笼蛋白衣被小泡以及植物和酵母的液泡膜上，是研究较多的一类新型质子泵ATPase(N．J．Nelson等，1989)，F和V－ATPase在结构和生化性质方面有许多相似之处，但这是两种不同类型的质子泵ATPase(Y．Wang等，1985)，在真核细胞中，酵最根本的区别在于酶复合物中各种亚基的基因分布，VATPase所有亚基的基因都分布在核DNA，F－ATase亚基的基因，有些在核DNA而另一些在细胞器DNA中。植物液泡膜H+－ATPase与所有的V－ATPase有类似的结构，J．M．Ward和H．Sze(1992年)的工作证明了这一点。他们采用Sephacrv 1 S－400凝胶过滤和Q－Sepharose离子交换的方法纯化燕麦根液泡膜H+－ATPase，经SDS－PAGE9%～15%的梯度分离，结果表明这个分子量为650kD的ATPase，由10种多肽组成，用KI和Mg2+－ATP溶液处理液泡膜微囊，释放出70、60、44、42、36和29kD的多肽，留在膜上的多肽并无水解ATP和泵质子的活性，这说明释放出的多肽为膜的外周蛋白。J．M．Ward和H．Sze提出的燕麦根液泡膜的结构模式图中，70kD的多肽为酶的催化部位，60kD的多肽为底物结合部位，16和13kD的两条多肽与膜脂结合形成脂蛋白，16kD的多肽可与DCCD(二环乙基碳二亚胺)结合，可能参与质子通道的形式。在嗜铬颗粒膜H+－ATPase的结构模式图中，它与溶酶体膜H+－ATPase有类似的亚基结构，水溶性部分有5五种多肽，脂溶性部分有16和20kD两条多肽与膜结合形成脂蛋白，39和115kD的两条多肽为附属亚基，溶酶体丰富的细胞含有大量可翻译为39kD多肽的mRNA，对编码这条多肽的基因已进行了克隆和序列分析(Y．Moriyana等1987)。目前在溶酶体膜H+－ATPase中尚未找到115kD的多肽，是否所有的V－ATPase分子中都含有这种高分子量的附属亚基，尚未定论。1992年M．S．Perin等人提出，高分子量的附属多肽应是各种来源的V－ATPase的共同成分，他们从笼蛋白衣被小泡H+－ATPase中分离出包括116和38kD在内的9条多肽，确定116kD的多肽由838个氨基酸残基组成，全肽分为两部分，氨基端一半含条水氨基酸残基多，这段疏水肽段多次跨膜折叠，根据疏水度推断跨膜片段的氨基酸序列和残基数(S．M．Perin等，1991)。
液泡膜H+－ATPase最明显的特征是被硝酸盐抑制和阴离子激活，对于燕麦根液泡膜H+－ATPase来说，各种单价阴离子激活的顺序为：Cl－，
，对叠氮盐和钒酸盐不敏感(Y．Wang等，1985)。液泡膜H+－ATPase的催化机理E．Uchida等用酵母在稳态和非稳态两种条件下作了研究。稳态条件下，反应混合液中有过量的ATP存在，酶催化ATP的水解采取多向循环路线非稳态条件下，反应液中仅有少量的ATP32，ATP的水解路线为单向循环。ATP首先与对NBD－Cl敏感的催化部位结合形成酶－ATP复合物，水解ATP生成的ADP和Pi先后从酶分子上释放出来，如果有过量的ATP存在，ATP作为正效应物激活催化部位，进行多向循环路线形成nATP．
复合物，既可以先释放出nATP，也可以先释放出ADP和
。在两种情况下，NBD－Cl都有抑制作用，它的作用是使催化部位失活，阻止酶－ATP复合物的形成，只有在ATP过量时，DCCD才有抑制作用，DCCD不影响酶与ATP的结合，这种催化机理模式与线粒体H+－ATPase的催化机理类似(C．Grubmeyer等，1983；M．Futai等，1988。为了说明液泡膜H+－ATP分子中与膜脂结合的小分子多肽在水解ATP中的作用，R．Hirara等(1989年)采用放射性失活分析法(radiarion inactivarion analysis)，把液泡膜微囊置于Co60γ射线下照射，两种ATP水解路线都受到抑制。对射线照射的敏感性，单向循环比多向循环多4倍，采取靶理论的方法，测定参与单、多向循环的多肽，其分子量分别为0．9～1．1×103和4．1～5．3×105D这说明在单向循环中只需要V－ATPase的A和B两个亚基参加，在多向循环中，V－ATPase必需有适当的寡聚结构，即(A，B)mCn，C代表与膜结合的多肽组分，其中m不小于3，在这种情况下，ATP水解与泵质子过程偶联，受DCCD的抑制。V－ATPase的各亚基基因克隆和序列分析工作进行的较晚。萝卜、脉孢杆菌和酵母液泡膜ATPase的A、B、亚基基因的序列分析已经完成，各种V－ATPase A，亚其的氨基酸序列测定有许多报道，结果表明，不同来源的V－ATPase亚基之间表现出极大范围的同源性(B．J．Boowmam等，1988；N．Nelson等，1989)。表1列出了F－ATPase的α，β亚基与各种V－ATPase的A，B亚基之间，相同氨基酸序列所占的百分比，可以清楚地看出，高等植物与真菌V－ATPase的亚基之间，相同的氨基酸序列占整个亚基总氨基酸的60%左右，B亚基更保守的约占70%，古细菌和真菌、高等植物的V－ATPaseA，B亚基之间的相同氨基酸序列约占50%，F－与V－ATPase之间的同源性表明，A与β，B与α之间的较密切的关系(N．Nelson等，1989)。根据分子遗传学的研究，普遍认为F－和V－ATPase在进化上有密切的亲缘关系，在F－和V－ATPase中两个大亚基的进化过程中，70kD的祖先H+－ATPase基因中含有编码ATP结合位点的GXXGXGKT氨基酸序列，这段序列在V和F－ATPase的A亚基和B型亚中都可找到。V－ATPasr的催化组分中，仅对E亚基进行了序列测定，它与F－ATPase的γ、δ和ε亚基均无相同的氨基酸序列，即无同源性。这说明γ、δ和ε是ATP合成酶所必需的功能肽，V－ATPase的D和E亚基是细胞器内酸化所必需的功能肽，这些亚基部是进化过程中后来加上去的(S．Hirsch等，1988)。编码牛嗜洛颗粒膜和酵母液泡膜V－ATPase的脂蛋白基因已经克隆，并进行了序列测定(V．P．Richard，1988)。在具有ATP合成酶功能的F－ATPase和古细菌的V－ATPase分子中，都有δkD的祖先脂蛋白基因产物。真核细胞中，V－ATPase的16kD的脂蛋白是ATP合成酶演变为具有质子泵功能，不再具有ATP合成酶功能的重要标志(M．Mandel等，1988)。K．Puopolot等(1990)使用各种技术对笼蛋白衣被小泡H+－ATPase进行结构分析，结果发现V－和F－ATPase的拓扑结构非常类似，在ATP或Mg2+－ATP存在的情况下，用促溶剂(如Kl、KNO2等)处理这两种酶，可溶性多肽从膜上离解下来，从V－ATPase上下来的多肽有73，58，40，34和33kD，被称之为V1，留在膜上的100，38，19和17kD的多肽，被称之为V2。两者的差别是：F1具有水解ATP的活性，V1则丧失了这种活性。深入的分子遗传学研究仍在进行。对于在植物细胞内离子平衡起中心调节作用的液泡来说，液泡膜H+－ATPase起着关键作用，日本学者Y．Ohya等人研究酵的Ca2+敏感cis系列突变体时发现，不能利用甘油、乳酸、琥珀酸等作碳源的pet－表现型，细胞内维持Ca2+的研究证明，Pet－表现型是由于液泡膜H+－ATPase的各亚基有不同程度的损伤，丧失了酸化液泡内环境的能力，导致Ca2+转运受阻(Y．Ohya等，1991)。V－ATPase在酸化细胞内各种细胞器内环境的过程中起重要作用，这种酸化作用为细胞内各种生理系列化反应提供了必要的条件，因此VATPase的深入研究对于医学和农业生产具有重要的理论和实际意义。(武汉大学王延枝教授、许献忠撰)