| 单词 | 抗体酶 |
| 释义 | 【抗体酶】 拼译：abzyme 抗体酶是抗体的高度选择性和酶的高效催化性巧妙结合的产物。它实质上是一种具有催化活力的免疫球蛋白，在可变区赋予酶的属性，所以也叫催化性抗体。抗体的多样性及精细识别性使其能束缚几乎任何有意义的分子，因此，抗体酶制备技术的开发预示着可以人为生产适应各种用途的特别是自然界不存在的高效催化剂，对生物学、化学和医学等多种学科有重要的理论意义和实用价值。 1952年，伍利(D．W．Woolley)推测，如果连续刺激抗体是够长时间，抗体则可能进化成为酶。1969年，詹克斯(W．P．lencks)根据波林(L．Pauling)的化学反应过渡态理论预言，如果找到针对某个反应过渡态的抗体，将其加入到该反应体系中，就可观察到其对相应化学反应的催化效应。这是因为抗体可束缚反应的过渡态络合物，使其能级降底，从而帮助大量反应物分子跨越能垒．达到加速反应的目的。由于实践中很难俘获过渡态，所以设计和制备稳定的过渡态类似物，代替过渡态作为抗原(半抗原)，就成为能否成功制备抗体酶的关键。由于对酶作用机理理解的差别以及实验技术的限制，长期以来，制出的抗体酶效率不高，甚至观察不到催化能力。虽然1975年单克隆抗体技术的出现为抗体酶技术的开发铺平了道路，但直到1986年抗体酶的研究才取得突破性进展。1986年，舒尔兹(P．G．Schuliz)小组认定对硝基苯磷酰胆碱是相应羧酸二酯水解反应的过渡态类似物。用这类似物作半抗原诱导产生单克隆抗体，经过筛选，找到一株MOPC167，使该水解反应速度加快12000倍。勒纳(R．A．Lerner，1986)小组根据金属肽酶的研究成果合成一个含有吡啶甲酸的磷酸酯化合物作为半抗原，得到一单克隆抗体6D4．用来催化不含吡啶甲酸的相应碳酸酯的水解反应，使反应加速近1000倍。上述两个小组成功的关键在于巧妙运用过渡态类似物。此后选择合适的过渡态类似物来诱导抗体酶得到了迅速发展，反应类型也不再局限于水解反应。目前，制备抗体酶的基本方法有3类：(1)用抗体来稳定带电过渡态：(2)用抗体作为熵阱：(3)在抗体的抗原结合部位引入催化基团和辅基。这些方法综合运用现代化学、免疫学和现代分子生物学的成就，使抗体酶催化反应的类型越来越多。除水解反应外，还有酰胺形成、光诱导裂解和聚合、转酯化、内酯化、消除反应、克莱森重排、金属螯合、脱羧反应、异构化和氧化还原反应等。这些抗体催化反应的专一性相当于或超过酶反应的专一性，催化速度有的可达到酶催化的水平，但一般地说，抗体催化反应速度比未催化反应速度快103～106倍。迄今，大多数抗体酶是通过理论设计和合成合适的与反应过渡态类似的小分子(半抗原)，然后让免疫系统产生针对半抗原的抗体来获得的。由于针对半抗原的抗体在几何形状和电学性质上与反应过渡态互补，因而可以稳定过渡态，从而加速反应。1987年，内珀(A．D．Napper)等用一个环化的磷酸酯作为过渡态类似物免疫动物．得到单克隆抗体24B11。发现这种抗体可催化外消旋的羟基羧酸酯分子内环化形成内酯反应，加速反应167倍．而且首次观察到抗体酶催化反应的立体专一性，反应产物中一种对映体的含量高出94%。波赖克(S．J．Pollack，1989年)等人也证明抗体酶可以立体专一性地催化非活化酯的水解，产物中一种对映体的含量比另一种高出100多倍。这个结果的重要意义在于，目前还没有一种化学方法可以产生立体专一性酯解催化剂。这类抗体可用于含有酸或醇功能基的合成中间物的手性拆分。1990年，舒尔茨小组利用与底物扭曲构象相似的扭曲卟啉作半抗原，制备的抗体可催化卟啉金属螯合反应。亚铁螯合酶是血红素生物合成途径中的末端酶，可催化亚铁离子插入原卟啉的生物合成。N－甲基原卟啉由于内部甲基取代而呈扭曲结构，它是此酶的有力抑制剂，也与酶催化的卟啉金属螯合反应的过渡态类似。针对甲基卟啉的抗体可催化平面结构原卟啉的金属螯合，这就为该反应过渡态扭曲结构的作用提供了证据。此项工作不仅说明抗体结合能可扭曲底物结构，而且表明可用抗体检验酶催化作用的机理。设计的其他半抗原是利用抗体结合能克服反应熵垒。巴特利特(P．A．Bartlett，1988)等合成一个有椅式构象的氧杂双环的化合物来模拟由分枝酸生成予苯酸这样一个克莱森重排反应的过渡态结构。用此双环半抗原诱导的抗体可使重排反应加速104倍。由于反应中不形成离子或游离基中间体，反应不需要酸、碱等催化基团催化，所以这项工作对采用非化学基团催化的抗体酶的发展有重要意义，它加深了人们对于酶作用机理中熵阱模型的理解。用抗体作为熵阱的另一个例子是抗体催化的狄尔斯－阿德耳反应。此反应是由二烯和烯烃产生环己烯，这在有机合成中很重要，但却没有相应的酶催化此反应。这种反应的过渡态是具有高能构象的环状物，反应中化学键的断裂和生成同时进行，因此常可观察到不利的活化熵。设计半抗原时不仅要利用临近效应，还要消除产物抑制，才能诱导出催化这一双分子反应的抗体。希尔沃特(D．H．Hilvert，1989)等成功地解决了这一问题。他们用稳定的三环状半抗原诱导的抗体可催化起始加合物的生成，然后立即排出SO2产生次级二氢苯邻二甲酰亚胺，抗体对该产物的束缚力很弱，因而显著加速反应。这个例子说明，抗体酶不仅可以催化天然酶不能催化的反应，而且通过半抗原设计还能解决产物抑制问题。有一种产生抗体的方法不是利用过渡态类似物，而是利用抗体－半抗原的互补性。抗体与其配体的相互作用是相当精确的，抗体常含有与配体功能互补的特殊功能基。已经发现带正电的配体常能诱导出结合部位带负电残基的抗体，反之亦然。肖凯特(K．M．Shokat，1989)等利用这种互补性，制备了针对带正电半抗原的抗体，在抗体结合部位上产生带负电的羧基，可作为β－消除催化作用中的碱功能基。他们获得的6个抗体中4个具有催化活性，其中一个抗体可加速反应105倍。后来证明，利用抗体－半抗原互补性是产生抗体的一般方法，可适合各类不同的反应，如缩合、异构化、水解反应等。抗体催化的下一个重要目标应是在其结合部位诱导出两个催化基团(两个酸、一酸一碱或两个碱)，进一步加快反应速度。很多酶的催化作用要有辅因子参与，这些辅因子包括金属离子、血红素、硫胺素、黄素和吡哆醛等。因此，开发将辅因子引入抗体结合部位的方法无疑会扩大抗体催化作用的范围。要做到．这一点，基本上有3种方法：(1)用多底物类似物一次免疫动物，可产生既有辅因子结合部位又有底物结合部位的抗体。小心设计半抗原可确保辅因子和底物的功能部分正确配置。此法已用于获得Zn(Ⅱ)为辅因子的序列专一性裂解肽键的抗体酶。将Co(Ⅱ)三亚乙基四胺连到肽底物上作为半抗原，免疫动物后产生抗体，其结合部位能适应肽底物、三亚乙基四胺和Zn(Ⅱ)离子。Zn(Ⅱ)上的开放配位部位可将羟离子传递到束缚底物的待断酰胺键的羧基碳上。此法还用于许多具有氧化还原活性的辅因子，如黄素、刃天青和依赖吡哆胺的反应。(2)用选择性化学修饰法即半合成法将辅因子或催化基团引入抗体结合部位。一般是先用可裂解亲和标记物将反应基团(锚功能基)选择性引入抗体的结合部位，再用这个反应基团作为锚，引入各种催化基团和辅因子。已用此法制备出含有活性部位巯基和咪唑基的具有水解活力的抗体。特别重要的是，此法并不需要了解目的抗体的三维结构，而且可以引入天然的和非天然的辅因子。(3)蛋白质工程即定点突变是产生抗体酶的另一个重要方法。1989年，舒尔茨小组用此法将催化基团组氨酸插入到对二硝基苯专一的抗体(MOPC315)的结合部位。这个组氨酸在酯底物水解中起亲和催化剂的作用。他们合成了VL片断的基因，其中抗体结合部位的Tyr34被组氨酸残基取代，然后用大肠杆菌表达重组的VL，再将此VL链与天然的VH链组合在一起，则得到具有显著酯解活力的抗体酶，反应加速105倍。1990年勒纳小组用定点突变技术将金属离子引入抗荧光素抗体的结合部位。半抗原－抗体的晶体结构显示，轻链互补性决定区中的3个残基在相对几何学上类似于碳酸酐酶锌结合部位中的3个组氨酸残基，因此，用His取代抗体残基Arg34L、Ser89L和Ser91L。为避免对金属结合部位可能产生的空间障碍，用Leu取代Tyr36L，经过这样改造后的抗体不仅仍能束缚荧光素，而且还能结合Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)。对Cu(Ⅱ)的束缚常数为2×105mol－1。这种将金属离子结合部位引入抗体的能力十分重要，因为金属离子可催化各种类型的反应。勒纳小组用λ噬菌体在大肠杆菌中构建一个庞大的单克隆抗体基因文库。他们用聚合酶链反应放大抗体的重链、轻链基因。放大的基因先插入不同载体，再随机重组得到表达文库，其中含有数百万个可分泌Fab的不同斑点。由于Fab可在大肠杆菌中表达，因此可用定点突变法修饰目的克隆。然而用此法表达的抗体还没有催化能力。温特(G．Winter)等采用另一种途径，即只表达VH文库，因为有时抗体结合部位主要在重链。文库里的重链可与具有功能基的轻链重组而产生新的抗体酶。抗体酶的研究还处于幼年时期，存在许多问题有待解决。然而抗体酶的研究实践清楚表明，它是研究酶作用机理的有力工具。尽管目前抗体酶距离实用阶段还很遥远，但已显出诱人的应用前景。具有酯解活力的抗体酶已用于生物传感器的制造。已经证明，抗体酶可以反相胶团和固定化的形式在有机溶剂中起作用，这为抗体酶的商业应用开辟了前景。具有立体专一性的抗体酶有助于解决化学合成中的对映体拆分问题，用于制药工业也很有发展前途。随着抗体酶催化反应类型的不断增加，抗体酶在生物学、化学和医学上的应用会展现更加诱人的前景。今后，抗体酶的研究重点是如何提高抗体酶的有效性。这要综合运用上述抗体酶制备方法，产生催化基团、辅因子和熵效应协同作用的活性部位。抗体的细菌表达系统的出现对此则会有极大的促进作用。【参考文献】：1 Pollack S J,acobs J W, Schultz. Science, 1986,234:1570～ 15732 Tramontano A, Janda K D , Lerner R A. Science ,1986,234: 1566～15693 Napper A D, Benkovic S J, Tramontano A,et al. Science, 1987,237:1041～10434 Bartlett P A,Nakagana Y,Jonnson C R,et al. J Org Chem, 1988,53:31955 Pollack S J, Hsiun P, Schuhz P G. J Am Chem Soc, 1989, 111:5961 ～ 59626 Hilvert D H, Hill KW, Nared KD,et al. J Am Chem, Soc, 1989,111:9261 ～ 92627 Shokat K M, Leumann C J , Sugasawara R, et al. Nature, 1989,338:2698 Baldwin E,Schultz P G. Science, 1989,245:11049 Cochran A G, Schultz P G. Science, 1990,249:78110 Iverson B L, Iverson S A, Roberts V A,et al. Science, 1990,249:659(吉林大学酶工程实验室罗贵民教授撰) |
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