| 单词 | 三链DNA的制备与生物学应用 |
| 释义 | 【三链DNA的制备与生物学应用】 DNA是生命活动的主要遗传物质，研究其结构与功能的关系，将有助于人们从分子水平了解生命现象的化学本质。 1953年，J．D．Waston和H．C．Crick提出的DNA分子双螺旋结构模型，使生物学各个学科进入分子水平，成为现代分子生物学的里程碑之一。科学工作者发现在生命体中存在一些非标准的B－DNA结构，如Z－，P－，A－型双螺旋DNA，甚至在某些生命体系中还存在单链形式的DNA分子。另外，在负超螺旋的超螺旋应力作用下，某些DNA序列经历了一个从B－DNA到非BDNA的结构转变，这包括重复序列的翻转形成的十字型结构、交替嘧啶嘌呤链形成的左手Z－DNA结构、具有镜面对称性的同型嘌呤－同型嘧啶序列形成的H－DNA(亦即绞链三螺旋DNA)等(R．D．Wells等，1988)。1957年，G．Felsenfeld等人首先提出三链核酸的概念，合成了一种三链RNA(poly A．2U)。当时被认为仅仅是一种有趣的反常现象。1973～1974年，S．Arnott等在X射线纤维衍射的基础上建立了简单的三链核酸分子模型，并提出三链核酸的结合方式，但缺乏足够的证据。直到1987年前后，几个小组在权威的《Science》和《Nature》杂志上几乎同时发表几篇关键性的论文，如前苏联S．M．Mirkin等从准天然途径(质粒DNA的酸性溶液)中发现一种DNA的三螺旋结构，为预测三链DNA在生物体内的存在提供了强有力的探索性证据。1987年，P．B．Dervan等证实可能通过将第3股DNA粘接到天然DNA上形成三链DNA，为三链DNA作为一种潜在的基因调控和精确切割DNA的“分子剪刀”等技术手段提供了可能。自此以后，三链DNA才逐渐为人们所重视，近年来，已经成为分子生物学和基因工程的一个前沿研究领域。三链核酸是由4个碱基组成的，只不过其基本结构单元为三碱基体，三碱基体是通过氢键作用形成的，有专一性。目前一般认为三碱基体有两种，其一为嘧啶－嘌呤－嘧啶，如TAT和CGC+等，其专一性体现在C不能接在AT上，而T也不能和GC形成氢键；另一种则是嘌呤－嘌呤－嘧啶，如CGC和AAT等，其专一性体现在A和G分别专一性地接在AT和GC上，当然理论上只要在适当条件下形成足够的氢键，就可以形成三碱基体。寻找能在更广泛的H+浓度范围内形成三链DNA的寡聚核酸有较为重要的意义。通过研究已经知道，嘧啶的5位取代衍生物能通过改变其疏水力、碱基堆积、三链DNA的Hoogsteen嘌呤－嘧啶对的电子互补，来改变它的H+浓度，从而能在中性条件下形成三碱基体(T．J．Povise等，1989)。1957年，G．Felsenfeld等首先提出的三链物是一种人工合成的三链RNA。60年代，人们主要研究了那些含有同型碱基或重复序列形成的三链RNA或DNA。如1964年M．N．Lipsett等第一次报道了GGC和C+GC三螺旋的形成，发现poly(C)和不同量的poly(G)反应可形成双链的和三链的化合物，而poly(C)和等摩尔量的双链化合物缓慢反应则形成三链物，并提出G+G+C和C+G+C的可能构象。但由于这些体系是由RNA组成的，被认为是一种有趣的反常现象而未引起人们的重视。70年代合成了许多三链DNA，主要研究它们的形成条件、热稳定性、结构特征。在这期间，S．Arnott等基于X射线纤维衍射，对三链RNA或DNA的结构进行描述，建立了三链核酸的分子模型，这些模型后来成为人们理解三链核酸的性质和功能的结构基础。80年代中期，三链DNA的研究才获得突破性进展。S．M．Mirkin等、P．B．Dervan等的研究为三螺旋DNA是否在体内存在，第三股寡聚核酸是否可作为序列专一性的探针用于染色体基因图谱研究和抗癌新药开发等方面，提供强有力的探索证据。自此以后，三链DNA才逐渐为人们所重视。白春礼等采用溴乙锭作为荧光探针，研究(dA)10和(dT)10间的相互作用。荧光滴定的实验结果表明，在中性(pH7．1)含镁离子的溶液中，确实观察到(dT)10·2(dT)10三链DNA形成；变温实验证实，溴乙锭的存在增强了三链DNA的稳定性。这个实验结果表明，溴乙锭荧光探针法不失为有效而灵敏的检测三链DNA形成的手段之一。在三链DNA研究的早期，主要集中在那些较短的同型嘌呤和同型嘧啶形成的简单三链DNA体系，后来才逐渐发展到对线性单链DNA和天然双螺旋DNA形成的分子间三链DNA体系进行研究。1978年，A．J．Rase等研究在T4连接酶催化作用下三链核酸的连接形成过程。他们在紫外吸收曲线上观察到三链核酸形成的理论拐点，低温下的吸收曲线表明同时存在三链物和双链物，证实在三链DNA形成过程中T4连接酶可催化T10与双链DNA的连接。研究者认为三链DNA的结构为A构型。1989年，P．Rajagopal等对两种八聚体，d(G－A)l及d(T－C)4进行一维的和二维的NMR谱与NOE谱研究，表明在中性pH下等量的寡聚物间形成B－型双螺旋结构；而在低pH下，混合溶液中同时存在双链和三链物；三链物的构型为A－构型；在酸性(pH5．0)条件下，能形成TAT及GCG+三碱基体，当pH提高到中性时，三螺旋又解离为双链组分和单链组分。这个研究资料表明，NMR可以作为检测三链DNA形成并获得其结构信息的一种强有力的手段。最近，人们为了增加通过形成三螺旋目标靶物进行专一性识别的分子长度和种类，探讨了采用环状寡聚核酸(G．Prakash等，1992)、含3’－3’链节、5’－5’链节、3’－5’链节以及含“之”字形结构的寡聚核酸(B．C．Froenler等，1992)等对目标DNA分子进行专一性识别的可能性。1990年．R．Haner通过形成纯粹的Py·PuPy三碱基组证实在线型单链DNA分子内能形成分子内三螺旋DNA。1991年，F．M．Chen使用光谱技术证实通过形成Pu·PuPy三碱基体，线性单链DNA分子内也能形成分子三链DNA。除有数的研究者外，通过形成三链结构对DNA分子内进行识别的研究，仅局限于使用含有寡聚嘌呤－寡聚嘧啶束道(tract)的单链核酸，而对任何碱基序列都能进行识别，必将有利于人们最大限度地利用那些基于通过形成三链DNA而实现的技术。针对这种要求，1990年D．A．Horne提出一些有意义的建议和设想，包括设计能结合具有交替寡聚嘧啶－嘌呤束道的双螺旋的单链DNA分子，但这要求在两个寡聚嘧啶链间有一个适当长度的非天然3’－3’或5’－5’或3’－5’链节。1992年，S．D．Jayasena和B．H．Johnston基于两类三碱基体在适当条件下都能形成的实验事实，设想到含有寡聚嘧啶和寡聚嘌呤块的单链可能同时通过形成这两种三碱基体，结合到含有邻近寡聚嘌呤－寡聚嘧啶束道的双螺旋DNA上，形成三链DNA。1992年，T．Kohwi Shigemalsu等研究了Escherichia Coli Cells的分子内dG·dG·dC三链DNA的形成。他们采用与未偶合DNA碱基专一性反应的氯乙醛作为化学探针，现场研究了含有质粒DNA和E．Coil细胞与不同长度poly(dG)·poly(dC)发生相互作用形成分子内三链DNA的可能性。结果表明，与长35bp、44bp和寡聚核酸反应能形成三链DNA，而与25bppoly(dG)·poly(dc)则不发生相互作用，而且在氯乙醛处理后的不到两小时，抽提的质粒DNA才显示出最大的超螺旋密度。规则的同型嘌呤－同型嘧型啶束道(dG－dA)n、(dT－dC)n和(dG)n、(dC)n经历一个负超螺旋诱导的强烈依赖于H+浓度的结构转变过程，形成一种新的分子内三螺旋(H型)DNA。1987年，S．M．Mirkin等认为这种H－DNA能在任何含镜面对称(H回文结构)的同型嘌呤－嘧啶序列中出现。他们通过使用一含AAGGGAGAAXGGGGTATGGGGYAAGAGGGAA(X或Y可以是A或G)特定序列的质粒作为模板，进行二维凝胶电泳实验。结果表明，当X=Y=G或X=Y=A(如质粒pAA32，pGG32)时，这个插入序列显出易发生向H型DNA的转变；反之，对于两个非回文结构(即X－A，Y=G或X=G、Y=A，如质粒pAG32、pGA32)，这个转变则相当困难或不可能。据此，他们测定了pAA32、PGG32、pAG32、pGA32四种质粒的超螺旋在诱导下向H型的结构转变，结果与预期的相同，前两者(含回文结构)发生预期的像具回文结构的同型嘌呤－同型嘧啶束道一样的依赖于pH值的结构转变，而后两者则更困难或不可能，结果说明H回文结构是那些能形成H－DNA的序列必须具备的条件。基于对H－DNA的深入研究和仔细分析有关H－DNA的形成，以及化学的、物理的、生物的实验结果(1989年)，H．Htun等提出一种H－DNA形成的可能机理：H－DNA的形成始于共聚物内部的一个小的变性包，即双链DNA在一边轻微旋转、回折，由此生成第1个三链碱基体，这种成核过程建立一种非平衡的HDNA构型。假定，任－DNA分子捕捉到一条处于亚稳态构型的DNA分子，结果当多聚嘧啶链在给体区域由于逐步的变性而松弛时，受体区域缠绕起多聚嘌呤链，缠绕与变性导致DNA分子负超螺旋的松弛，从模型中可以预测DNA超螺旋的大小决定(dT－dC)n的那一半将要变成给体第3条链。在这个机理中，HDNA形成过程中的关键被认为是在那些重复内部的第1个三碱基体的形成(即成核作用)。对三链DNA而言，尽管缺少详细的X－射线晶体结构数据，但是从上面所讨论的有关作为辅助手段的化学的、物理的和生物的证据表明：三链DNA的结构单元是三碱基体，它也有专一性；三螺旋DNA的形成是通过第三股螺旋缠绕到双螺旋的大沟上形成的，第3股DNA与双螺旋DNA中的一条链是通过形成Hoogsteen氢键而发生相互作用的；同时，三螺旋的形成还要考虑链的相对极性；有证据表明螺旋有可能是采用A－构型的。近年来，三链DNA已引起人们的广泛关注，但早期对三链DNA的生物学功能有着不同的猜测，比较有代表性的是双链DNA和单链RNA的相互作用对基因表达的控制可能会有调控的功能，A－型三螺旋可能是转录过程中所需要的，这在富含dT和dA的DNA中尤为可能；同时；三链核酸对不同的DNA、RNA聚合酶可能还会起抑制作用(A．J．Raae等，1978)。现在三螺旋DNA在提供控制基因表达的手段和发展序列专一性DNA切割试剂等方面，显示出应用的可能性。三链DNA能否在体内存在．一直是人们所关心的一个重要问题。通过研究发现，有几个支持三链DNA在体内能存在的证据。首先，嘌呤－嘧啶束道(其中有些甚至长度达到100bp或更长)在真核基因中的含量高达1%左右，由此可能形成三链DNA的序列的浓度是相当大的。其次，发现在基因的5’－端区域存在许多嘌呤－嘧啶束道，而这些区域无论在体内或体外对单链核酸专一性酶敏感。众所周知，双螺旋DNA形成三链DNA要求存在第3条单链核酸。再次，存在一个结合老鼠、人和多线染色体基因的三螺旋专一性抗体，这个结合作用能通过竞争性三螺旋的加入而被阻止，但加入那些不能检测到三螺旋形成的DNA则没有这种现象发生(C．Helace等，1982)。S．M．Mirkin等在酸性质粒溶液中发现的一种H－DNA，为探索三链DNA在体内的存在提供了一个最有力的推动力。后来，T．Kohwi-shigematsu等揭示了在体内和体外三链DNA的形成对长度的依赖性，在此细胞内H－DNA的形成，表明利用三链DNA的形成，可能对细胞内那些，涉及DNA的过程产生影响。1991年，K．J．Hampel等通过包括热变性、歧化动力学及其他实验证实，在H+浓度为10－7mol／L下，少量多胺(生理浓度)的存在对三链DNA的形成有着促进作用。研究者据此推测，在真核细胞核小体中也许确实存在三链DNA。基因表达调节，涉及通过控制蛋白和调节核酸对来对碱基序列或碱基结构进行识别(T．C．Boles等，1987)，这是在基因表达水平上控制细胞内过程的关键，这些识别可以出现在每个双螺旋DNA的水平上。合成的寡聚核酸和反义RNA都能用作人工控制基因表达的手段，在那些实验中的大多数情况下，信使RNA和寡聚核酸或反义RNA间形成一种负责捕获转译的复合物，短的寡聚核酸能介入DNA的转录过程，由此可以假定，它们可作为那些未配对DNA的目标靶物，因为DNA和mRNS之间的那些未配对区域的大小通常都有一定的限制。因此，必须增加那些寡核酸对目标靶物体进行识别的精确性(R．D．Wells等，1988)。研究者们发现，同型嘌呤同型嘧啶束道常出现在基因的调控区域(T．L．Davices等．1989)，也常作为专一性序列结合因子的目标(R．D．Wells等，1988)。在超螺旋应力下，同型嘌呤－同型嘧啶束道高度倾向于形成一个非B构型的DNA．这导致在基因表达控制方向DNA的结构变化有可能起重要作用。1987年，M．E．Hogan等根据体外，在人体c－1nyc基因特殊位置上的DNA与寡聚核苷酸的结合作用，提出三链态的形成可能是体内基因控制的基础。1991年．Y．Kohwi等发现在老鼠L细胞中引入的poly(dG)·poly(dC)序列，能增强其转录基因的转录活性，并发现这种效应依赖于所引入序列的长度：25～30bp和dG束道强烈地增强转录的活性，而长度为30bp或30bp以上的dG束道则不影响其活性。考虑到由poly(dG)·poly(dC)序列形成的H－DNA也存在这种长度的依赖性(在对质粒DNA形成三螺旋的研究中发现的)，可以合理地推断出H－DNA也许能在体内形成，且能影响基因转录和表达。在应用方面，此技术的主要限制是在体内寡聚核酸对限制性内切酶的存在很敏感。为此，1987年C．Helene等发展了一种能被光化学激活而在寡聚核酸的目标序列上产生交联或光敏性破坏的试剂。由此可能开辟一条在活体内能进行专一性控制基因变异或失活的新途径。这些研究结果表明，作为基因表达的反义抑制物和基因活动的调节信号，人工合成的寡聚核酸可在基因的特异位点上通过形成三链DNA阻止基因转录。专一性精确切割双链DNA是染色体图谱、基因分离和DNA测序的关键。能识别长8～10bp的限制性内切酶已被广泛使用于基因图谱的研究中，但它们数量较少，且仅局限于对富含CpG序列的识别，而且它对大分子基因的切割常导致高聚化。最近发现，限制性内切酶Ⅰ也许有比12bp大一些的专一性。遗憾的是，没有一种方法可作为一种普遍适用的方法，对那些出现在人体DNA中的大量特异性序列进行识别，并对其进行专一性切割。由于生物的基因组相当大，必然存在许多可以被酶切的小DNA片段，假如那些酶识别的序列远大于4～8bp，就可极大地减少基因组上的切点数目。寡聚脱氧核苷酸与双螺旋形成三链DNA，是序列专一性键合双螺旋的化学新进展。研究资料表明，它们比限制性内切酶的专一性要高106倍(M．N．Lipsett等，1964；A．D．Horne等，1990；T．L．Doan等1987)。因为通过寡聚嘧啶形成的三链DNA，仅仅局限于嘌呤束道，因此人们渴望寻找到一个在天然条件下(37C，pH7．0)能键合所有的4种碱基的普通方法；通过系列研究，1989年D．B．Dervan及其合作者发展了一系列达到这一目的的方法：(1)寻找天然以外的专一性三链碱基组，如G．TA；(2)设计形成三链密码的非天然碱基；(3)设计能结合双螺旋DNA的不同链的寡聚核酸以及其他方法，如1989年他们证实寡聚核酸能协同结合双链DNA模板。1990年，在酵母染色体上通过寡聚核苷酸形成三链DNA，实现了特异性切割。1989年，Dervan和Luebke研究通过在双链DNA与寡聚脱氧核酸之间形成非酶络合物的过程。这些研究资料表明，三链DNA能作为一种有效的精确切割DNA分子的剪刀。除了以上的应用外，三螺旋DNA的形成可能有其他方面的应用，首先它可能与染色体的凝聚有关。1988年，G．D．Burkholed等利用三链DNA的单克隆抗体，发现细胞核染色体上有三链DNA存在，细胞周期中结构型染色质都含有数量较少但稳定的三链DNA。这表明在细胞周期中三链DNA的存在，可能与染色体凝聚有关，并可作为真核DNA结构的一种固有特征。其次，三链DNA可用于发展一种序列专一性的纯化分离DNA的新方法。1992年，T．Ito等利用三链DNA的形式，成功地从异源DNA混合物中专一性地分离和富集出目标DNA分子。(中国科学院化学研究所方晔博士、张平城博士、博士生导师白春礼研究员撰) 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