【血液中碳氧血红蛋白(HbCO)的分析方法】
－氧化碳中毒是一种常见的中毒性疾病，而碳氧血红蛋白含量测定在临床上诊断急、慢性CO中毒具有重要的参考意义，可作为CO作业者的一项生物监测指标。血液HbCO的分析方法很多，并不断更新。老的方法如Vanslyke及空针－毛细管(lsyringelapillary)气量法由于用血量多，费时、准确度低，已被淘汰，代之以用血量少，灵敏度高，使用方便的仪器分析，得到了较满意的结果。从所获资料来看，国外血中HbCO分析主要用在人群调查，分析手段主要是分光光度计、气相色谱议及其他专用仪器。而国内除作人群调查外，临床中毒病人的分析占有较大的比重。气相色谱法国内还较少使用。许多医院临床分析中还在用经典的化学定性、半定量法。因此准确度较差，只能辅助诊断严重的CO中毒，而仪器分析在灵敏度、准确度都大大提高，只需微量血即可满足临床快速分析及人群调查。血液HbCO分析，使用者可依据分析原理及技术条件，而采用适当的方法。血液的处理都基本相同，取耳垂、静脉或指尖血，尸体可取胸腔血。加适量的抗凝剂。 下面对各类方法的原理、分析条件及其他有关指标作一比较。1．经典的化学定性与半定量。此类方法多为临床在不具备优良仪器的条件下，作为应急定性分析时采用。主要有简易加热、氢氧化钠、漂白粉、分光镜、沉淀分离比色等方示。这类分析方法简便、快速，但准确度、灵敏度都很差。2．分光光度法。分光光度法是目前国内外检验血中HbCO采用较多一种方法。所需分光光度计(72、721、751型)多数实验室都具备，只在波长及实验条件方面可有多种不同的选择。其用血量、操作简繁，分析结果的准确度，依所选方式不同而有一定的差异。但基本原理大致相同。都是利用HbCO、HbO2、Hb及HbMet在特定波长下的吸光度差别，经测定后将结果作简单数字处理得到HbCO的含量。(1)双波长555／568nm。本法在日本奥园、玉川、服部及松原代所著方法的基础上改为超微量法。原理是在血液中加入连二亚硫质钠后，HbO2及MHb立刻变成Hb，而HbCO不变，血中只含Hb与HbCO二元组分，其光谱555、568nm波长处可体现较大的吸光度差异，在此波长下比色便可测出HbCO的含量。该法计算公式为：
S为Hb和HbCO饱和率，Q为E568／E555 ε为Hb和HbCO在555、568nm下的摩尔吸光度。以上式计算求S制成工作曲线(或表)更为方便。工作曲线略成下凹形。本法用血量0．02ml测定的精确度1．2%，最低标出限为0．3%(HbCO)。测定结果：非吸烟正常人(女中学生)20例，其S范围在0～2．4%，平均S为0．525%。与日本国相应测定的结果0～2．4%，平均S为0．515%的值差异很小。同时对不同人群职员、农民、吸烟者、工人)上班前20min与工作后5h及对长期接触高浓度CO98例分别进行了测定，其结果基本上能反映出不同人群，班前与班后及工作环境的不同的差异。同时对急性中毒20例患者进行了测定，其结果符合临床症状和体征，并于CO定性实验平行。在操作方面同捷克J．Teisinger等人及日本奥园等人的2种方法作了对比，认为比二法各方面均优越。(2)双波长530．6／583．0nm。在HbO2和HbCO吸收谱中，二者互相交迭，不可能分开测量，但可找到λ1和λ2一对波长，使其中HbO2吸光值ΔAHbo。=Aλ1－Aλ2=0，而HbCO不为零，可反映出HbCO的浓度。本法需双波长分光光度计，测量灵敏度HbCO0．7%，可测出HbCO低于10%的血样，用血量为0．02ml。该法对47名吸烟者，50名非吸烟者进行了测定，能反应出不同的差异。(3)双波长432／420nm。HbCO最大吸收在420mm、Hb为432nm、测出血样的二波长吸光值，代入公式，求得HbCO含量。计算公式为：
A为测定值，α为摩尔吸光度。需先测得HbCO和Hb在选用二波长下的摩尔吸光度作为常数，可长期使用。但需保证仪器使用条件不变。波长稳定。本法用耳血0．005～0．01ml，与气相色谱测定法作了比较。相关系数γ=0．992，只在HbCO低于2%时，分光光度法准确度下降。(4)三波长法。法L．Arthur．等采用三波长法，通过3个联立方程，同时求出Hb，HbCO和HbO23种成分的浓度。用血量0．4ml。精度Hb为0．1gm／dl，HbO2，HbCO为(饱和度)0．2%。(5)四波长法。本法取稀积血样测定392、413、421、431共4个波长的吸光值，然后联立解3个方程，同时可求得血中HbCO、HbO2、HbMet3个浓度值。方程中3种成分摩尔吸光值需事先测定。作为常数。该法用血量0．1ml，同气相色谱法作了比较，HbCO为10%以上时，两种方法相关性很好。(6)B．T．Commins的五波长法。本法是将稀释血样分成两部分，一部分用O2处理软化为HbO2，将此试样置入分光光度计参考光路，未用O2处理的样品置于测定光路中。在420．2nm下测定。记录值是2种样品吸收之差确定HbCO浓度。为便于测定高峰，也可在414和426nm波长测定。Hb总量可测定完全氧化的样品在575、559nm波长的吸光值之差来得到。用血量0．01ml。3．气相色谱法。气相色谱法用在HbCO测定上可获得很高的录敏度与准确度，优于分光光度计，但需要较高的仪器条件及较好的操作培训。气相色谱依样器的前处理不同而采用特定的检测体系。(1)火焰离子检测器。Guilloe等人采用的方法是在铁氰化钾的存在下，加热待测血样，使CO释放出来。用分子筛将CO与其他气体分离。然后在400℃下，使CO通过含有Ni催化剂的柱子与氢气仅应生成甲烷，甲烷经火焰离子检测器检测。本法及分光光度法同时测定了275个样品，HbCO低于2%时，二法相关系数γ=0．885，高于此数时γ=0．953。用血量1ml。(2)热导检测器。L．D．Hobbs用H2SO4将稀释血样中的CO释放出来，经热导检测器所测。O2N2和CO同时出峰。记录CO峰高可得CO含量，将同一血样软化成HbCO后，再经同样方法得到的CO总结合量，计算后得到HbCO百分含量。用血量2ml。以上是近年来国内外用的较多的几种HbCO分析方法。在中国目前基层医院尚未推广气相色谱法，以分光光度法分析HbCO含量比较适用。通过仔细选择分析条件，可提高准确度。用于临床及人群调查，同样可取得较满意的结果。【参考文献】：1 van Slyke D D，et al．The determination of carbon monoxide in blood．J．Biol．Chem．1919，40：1032 Roughton P J w et al．The estimation of small amounts of carbon monoxide in blood．J．Biol．Chem．1945，147．1233 周恒铎主编．职业中毒检验．北京：人民卫生出版社，1976．4914 大连化工厂医院工业卫生科．关于用超微量法测定碳氧血红蛋白的商讨．19775 Alfred Ramiedi，Jr，Peter Jatlow，et al，New method for rapid determination of carbonxyhemoglohin by use of double-wavelength spectuophotometry．Clin Chem．20／2 278 1974．6 Rodkey Flee Thomas Hill A et al，Spectrophotometric measurement of carboxyhemoglobin and methemoglobin in blood．Clin．Chem．1979，25／8，1388 19797 海军总医院中心实验室．血液碳氧血红蛋白(HbCo)分光光度测定法及临床应用(未发表)19848 Arthur L．Malenfant，et al．Spectrophotometric determination of hemoglobin concentration and per cent oxyhemoglobin and carboxyhemoglobin saturation Clin．Chem1968，14：7899 Kenneth A S，et al．A rapid method for simultaneous neasurement of carboxy and methemoglobin in blood．J．Appl．Physic．1971，131(1)：15410 Commins B T，et al．A sensitive method for the determination of carboxyhemoglobin in a finger prick sample of blood，Brit．J．Industr．Med．1965，22，139(大连化学工业公司工业卫生科李美兰撰) |