“病毒性心脏病的分子生物学研究”的概念、定义、翻译、参考文献-科学参考

单词

病毒性心脏病的分子生物学研究

释义

【病毒性心脏病的分子生物学研究】

病毒性脏病(VHD)包括病毒性心肌炎(VMC)及VMC转化而致的扩张型的心肌病(DCM)。肠道病毒(EVs)与VHD关系密切，其中又以柯萨奇B组病毒(CVBs)及埃可病毒组最为明显。VHD临床诊断极难确定，其发病机制及沿疗的研究因此难以深入。

心肌膜心肌活检(EMB)虽可证实VHD的病理改变，但因罕能分离到相关病毒，无法与其他心肌疾病鉴别。1985年德克(G．W．Dec)等证明在VHD流行性发病时，检测血清抗EVs抗体有助于病因学诊断。但多数情况下此类血清学方法交不即证实或排除心肌病毒感染研究。1984年特蕾西(S．Ttacy)及海皮埃(T．Hyypiä)同时尝试将分子遗传学技术用于EVs研究，以核酸休交方法检测EVsRNA。后者科学家首次证明了诸多CVBs间上遗传学同源性。1988年沃纳(S．Werner)等以含CVB3基因组高保守区质粒转染细菌，合成CVB3蛋白，再用合成产物免疫动物，获得抗血清。结果发现此种抗血清对各种EVs的交叉反应谱远广于以EVs直接免疫动物所获提的抗血清，为以分子免疫学技术研究VHD打下基础。

多数EVs间RNA序列的同源性高达70%～80%。1990年克拉姆(W．Klump)等将CVB3RNA与已知的CVB1及CVB4RNA比较后，发现三者间核苷酸序列同源生为80%，而氨基酸序列同源性竟达90%。这种高度的遗传学同源性以某一EVs基因组的cDNA片断作为探针检测多种EVsRNA提供了理论依据。检测EVsRNA的分子遗传学方法包括核感性不低，可测出3×107～1×106个病毒RNA拷贝(相当于10pg)。1986年鲍尔斯(N．E．Bowles)等首先将打出点杂交方法用于临床VHD的诊断。他们后又证明经病理确诊的心肌炎及OCM患者中心肌日／SRNA检出率达35%～55%，而其他特异性心肌疾病EMB标本杂交结果均为阴性。原位杂交可在原来细胞、组织环境中识别及鉴定病毒基因组，获得精确的组织细胞均为阴性。原位杂交可在原来的细胞、组织环境中识别及鉴别病毒基因组，获得精确的组织细胞学定位。1987年坎朵尔夫(R．Kandolf)等在培养细胞中建立了EVsRNA原位杂交方法，交在小鼠VMC模型是证明其敏感性甚高，可测出20拷贝的EVsRNA。到1989年，他们在24．7%(23／93例)VMC及16．7%DCA患者EMB标本检出EVsRNA，而53例其他心肌疾病患者EMB标本均未获阳性交信号。1991年休林(U．Shonian)等以巨细胞病毒(CMV)cDNA探针检测VMC及DCM患者EMB标本，发现部分患者心肌中存在CMV基本组，证实除EVs外其他病毒亦可引起VHD。PCR技术可大量扩增DNA，扩增产物可直接测出。检测RNA时则需先以拟检测RNAS部分为模板合成cDNA，再进入PCR循环。VHD时心肌中病毒拷贝数往往很小，PCR特异性扩增EVsRNA，可能会提高检测敏感性及特异性。1990年金(O．Jin)等以PCR方法检测48例拟诊VMC及DCM患者EMB标本，结果5例(10．4%)检出EVsRNA。分子遗传学方法优点虽多，但仍未能在临床上取代免疫学方法。这主要是由于取材困难、操作复杂及多数临床实验室不具备条件。

将病毒蛋白通过分子克隆方法在细菌中表达，再用表达产物免疫动物，可获得抗病毒蛋白——特异性抗血清。1989年沃纳等以该技术制备出两种抗CVBs结构蛋白为主的融合蛋白抗学清，并经免疫吸印证明这种抗血清可作用检测EVs的广谱试剂。1990年福利斯(A．K．Foulis)等证实用重组CVBs结构蛋白VP1抗血清原位免疫组化技术可检出实验中用到的所有9种EVS。他们检测了20例尸解心肌标本(均疑死于VMC)，12例获得阳性结果。

分子生物学研究提供了病毒直接伤心肌的证据。1987年坎朵夫等以核酸杂交，显示CVB3性心肌炎小鼠模型中CVB3RNA明确定位于心肌细胞内。他们还观察到受感染细胞由心肌纤维化区域向未受感染区扩展，认为这是细胞－细胞间播散的结果。以抗重组CVB3结构蛋白VP1抗血清作免疫组化检测，亦发现含VP1心肌多伴有坏死。动物实验及临床资料提示心肌EVsRNA存在与否及受感染细胞量与心肌炎症轻重在相关性。

慢性VMC及DCM患者心肌中有持续性病毒感染：(1)10%～50%DCM患者心肌中检出EVsRNA；(2)对由心肌炎向DCM转化的患者进行的连续性检测，证实心肌中有EVsRNA持续存在；(3)心肌EVsRNA阳性的患者既往多有符合VMC的病史。EVsRNA如何在免疫正常的宿主中持续存在，意见尚不统一。但多数作者认为可能与控制EVsRNA复制的基因突变有关。1991年霍亨纳德尔(C．Hohenadl)等以股特异性原位杂交，发现急性CVB3性心肌炎动物模型心肌中正股病毒RNA含量远大于负股含量。而1990年坎宁安(L．Cunning-ham)等在慢性疲劳综合征(一种慢性CVBs感染性疾病)患者肌内活检标本中发现正负两股EVsRNA含量几乎相等。他们认为病毒RNA两种互补股的等分子量合成可能抑制病毒－特异性产物的翻译，并提出这可能就是不装配感染性子代病毒及不引起炎症性反应的原因。VHD时EVsRNA持续存在机制是否亦如此尚无定论。心肌中的EVsRNA持续存在的意义也不甚明了。但DCM患者心肌中能检出EVsRNA，至少提示伴此种状态的VMC患者易于发展为DCM。

自身免疫机制的VHD发病过程中的作用已基本肯定，分子免疫学技术则进一步拓宽了研究进路。1985年以来，舒尔塞斯(H－P．Schultheiss)等致力研究抗ADP／ATP载体抗体与VHD的关系，认为该抗体在VHD发病机理中具重要作用：(1)60%～90%VHD患者血清中可检出该抗体；(2)60%该抗体阳性的DCM患者血清中可抑制线粒体－细胞质ADP／ATP转运；(3)经ADP／ATP载体免疫的动物离体心功能明显减弱；(4)该抗体与细胞膜表面的抗原决定簇有交叉反应。风湿热时A组链球菌M蛋白变异体M5含与心脏肌凝蛋白重链相似的抗原决定簇。1991年纽曼(D．A．Neumann)等在研究可中和CVB4的单克隆抗体(McAb)时，发现该McAb可与心脏肌凝蛋白重链发生交叉反应，提示VMC病程中有与风湿热相似的自身免疫机制。以心脏肌凝蛋白重链免疫同种动物可诱发与CVB3性心肌炎相同的心肌病变。1989年白塞尔(K．W．Baisel)等研究了可与肌凝蛋白重链反应的McAb356－1与CVB4的关系，发现356－1能与现CVB4结构蛋白VP1结合，认为分子似机制参与VMC发病过程。

VHD至今尚无特效疗法。1989年，岸下(C．Kishimoto)等研究了以基因工程方法生产的重组人白细胞干扰素至少aA／D对小鼠VCM模型的防治效果。发现在接种病毒前给药可有效抑制心肌中病毒复制，减轻心肌炎症反应。他们认为药在EVs感染流行时可能有益于预防VMC发病。1991年施姆贝克(P．L．Schwimmbeck)等以人工合成肌凝蛋白重链或ADP／ATP载体的部分多肽吸附VMC或DCM患者血清，结果去除了95%以上的自身抗。

分子生物学技术为VHD的研究带来新的希望，若能用作常规诊疗方法可能会有利于改变VHD临床工作的紊乱状况，但其实用价值尚待实践证明。在VHD发病机制研究中若能同时使用股特异性原位杂交及原位分子免疫技术定量检测EVsRNA及结构蛋白，则会有助于阐明病毒持续存在的原因及其意义。以分子生物学技术监测心肌病毒基因组，指导VMC治疗，可能筛先出胡效的抗病毒素药，且可以剔除可能促进病毒素复制的药。若以有将近的抗病毒药治疗心肌持续性病毒感染的患者，可能减轻慢性VMC患者病情，甚至减少DCM发病率。

【参考文献】：

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(上海市心血管管病研究所杨英珍研究员、徐岩博士撰)

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